ELEKTROFORESIS

ANALISIS ASAM  AMINO DENGAN METODE ELEKTROFORESIS SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate – polyacrilamide gel electrophoresis)

Latar Belakang

Dalam protein terdapat 20 asam amino utama yang berperan sebagai pembangun. Masing - masing asam amino berbeda satu dengan yang lain pada rantai sampingnya atau gugus R. Asam amino yang dapat disintesis sendiri oleh makhluk hidup disebut asam amino non-esensial, sedangkan asam amino yang tidak dapat disintesis sendiri dan harus diperoleh dari makanan disebut asam amino esensial (Toha, 2001).

Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik. Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik dari cikal-bakal elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid. Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik. Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik.

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate – polyacrilamide gel electrophoresis) adalah teknik elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein di laboratorium. Sempel protein denaturasi (dipanaskan) dan dicampur dengan SDS (yang merupakan detergen yang anionik) dengan akibat kompleks protein-detergen itu bermuatan negatif dan protein yang lebih besar menpunyai muatan negatif yang lebih besar.. Kompleks protein-detergen itu akan dibawa oleh medan listrik ke arah kutub positif (anoda). Gel akrilamide berfungsi sebagai dasar atau alas atas gerakan sampel protein. Konsentrasi akrilamide menentukan ukuran pori-pori gel dan ukuran pori-pori gel menentukan jarak yang ditempuh oleh kompleks protein-SDS. Jadi berapa faktor harus ditentukan untuk memaksimalkan pemisahan protein-protein melalui teknik SDS-PAGE (antara lain: kadar SDS, konsentrasi gel akrilamide dan ukuran gelnya, kemurnian sampel protein dan jumlah sampel yang diletakkan pada gel; voltage yang digunakan pada alat elektroforesis dan selama medan listrik dihidupkan).

Analisa kualitatif protein dapat menggunakan kromatografi ataupun elektroforesis tergantung pada tujuan analisa. Dalam prakteknya, baik analisa kualitatif maupun kuantitatif dapat dipakai secara terpisah ataupun dipakai secara bersamaan dalam suatu rangkaian analisa. Elektroforesis protein gel poliakrilamida SDS dianggap sebagai prosedur yang lebih baik dibandingkan dengan metode-metode analisis yang terdahulu terutama karena dapat digunakan untuk memisahkan jenis-jenis protein, termasuk protein-protein yang tidak larut dalam air.

Elektroforesis Gel Poliakrilamid

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Gambar 1. Susunan Elektroforesis

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = poly-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Gel poliakrilamid dalam dibentuk sebagai silinder dalam tabung atau sebagai lembaran dalam lempengan kaca. Dalam perangkat elektroforesis, gel diletakkan diantara dua buffer chamber sebagai sarana untuk menghubungkan kutub negatif dan kutub positif. Orientasi posisi gel dapat secara vertikal dan horisontal atau disebut sebagai submarine.

     

           

Gambar 2. Lempengan kaca pembentuk Gel            Gambar 3. Perangkat elektroforesis

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya

.

Protein merupakan molekul amphoter karena mempunyai gugus amino positif dan gugus karboksil negatif. Dengan demikian maka protein dapat mengion baik pada pH basa maupun pH asam. Pada pH rendah, protein bersifat sebagai kation (bermuatan positif) yang cenderung bergerak ke arah katoda (bermuatan negatif). Pada pH tinggi, protein bersifat sebagai anion (bermuatan negatif) yang cenderung bergerak ke arah anoda (bermuatan positif). Nilai diantara kedua pH tersebut dinamakan titik isoelektrik (isoelectric point atau pI) yaitu nilai pH dimana protein menjadi tidak bermuatan. Hal ini karena pada pH tersebut jumlah muatan negatif yang dihasilkan dari proteolisis sebanding dengan jumlah muatan positif yang diperoleh dari penangkapan proton. Protein yang tidak bermuatan tidak dapat bergerak pada medan listrik. Hampir semua protein mempunyai pI kurang dari 8,0. Oleh karena itu, pH bufer elektroforesis berkisar 8 – 9 yang akan menyebabkan sebagian besar protein bermuatan negatif yang akan bergerak ke anoda.

Gambar 4. Skema Mekanisme Separasi Protein Berdasarkan Berat Molekul dengan SDS PAGE

Elektroforesis Gel Poliakrilamid pada Kondisi Disosiasi

Protein dengan berat molekul besar, protein kompleks atau asam nukleat biasanya dielektroforesis pada kondisi terdisosiasi yaitu dengan mengganggu struktur nativenya. SDS merupakan detergen yang mempunyai sifat polar dan nonpolar yang dapat mengikat protein sedemikian rupa sehingga bagian nonpolar dari SDS tersembunyi ke dalam bagian nonpolar (hidrofobik) dari protein dan gugus sulfat dari SDS yang bermuatan negatif berhubungan langsung atau terekspos pada pelarut.

Berdasarkan preparasi sampel, elektroforesis dibagi dua yaitu : (1) native atau nondenaturing atau nondisosiasi PAGE, dan (2) denaturing atau disosiasi atau SDS-PAGE. Pada sistem native atau nondenaturing PAGE (non-dissociation), protein diseparasi pada bufer yang mempunyai pI tertentu. Ketika bergerak di dalam gel, protein tetap berada dalam struktur tiga dimensi (native). Ukuran suatu protein ditentukan oleh berat molekul, tingkat hidrasi dan bentuknya. Pada sistem ini, sulit memperkirakan pola migrasi protein. Pada umumnya, sistem ini hanya dipakai untuk memisahkan sampel dengan berat molekul yang sama berdasarkan muatannya.

Pada sistem denaturing, protein dielektroforesis pada bufer yang juga mengandung detergen ionik SDS. SDS akan mengikat pada bagian hidrofobik dan residu asam amino sehingga menyebabkan perubahan struktur tiga dimensi protein (menjadi unfolding). Selain itu, SDS juga menyebabkan seluruh rantai peptida bermuatan negatif (Gambar 7). Dalam kondisi ini, ukuran protein hanya tergantung pada berat molekulnya. Kompleks protein-SDS bergerak dalam gel poliakrilamid dengan kecepatan yang tergantung pada berat molekulnya. Dengan demikian maka, SDS-PAGE digunakan untuk menentukan berat molekul suatu crude protein.

Gambar 5. Struktur Molekul SDS dan Pengaruhnya pada Struktur Protein

            Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak dengan kata lain mobilitisnya tinggi. Sebaliknya, protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek dengan kata lain mobilitisnya rendah. Berbagai jenis protein pada suatu sampel akan terseparasi (terpisah-pisah) pada gel poliakrilamida tergantung pada mobilitasnya. Protein dengan mobilitas tinggi akan berhenti bergerak pada bagian yang lebih bawah gel, sedangkan protein dengan mobilitas rendah cenderung berhenti bergerak pada bagian atas gel. Dengan demikian, pada jalur pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein (disebut sebagai band atau pita protein) yang sudah terseparasi berdasarkan berat molekulnya. Dalam satu sampel protein bisa lebih dari satu bahkan puluhan band dalam gel poliakrilamida. Dalam kondisi tidak diwarnai, protein tersebut tidak terlihat karena memang protein dalam sampel tidak berwarna. Setelah diwarna dengan staining solution yang mengandung Coomassie brilliant blue R-250, protein yang tidak berwarna tersebut menjadi berwarna biru karena mengikat Coomassie blue. Dalam kondisi ini kita bisa mengetahui keberadaan dan mengukur mobilitas protein untuk kemudian ditentukan berat molekulnya.

            Coomassie blue dapat mendeteksi 1-10 g protein dalam satu band, sedangkan untuk mendeteksi protein dengan kadar yang sangat kecil (10-100 ng) digunakan pewarnaan perak nitrat yang 100 kali lebih peka. Prosedur dan mekanisme pewarnaan dengan perak nitrat serupa dengan proses cetak foto. Protein pada gel akan mengkatalis proses reduksi silver halida pada larutan pewarna menjadi metallic silver yang bisa dilihat.

Gambar 6. Hasil Separasi Protein pada SDS-PAGE sesudah Diwarnai Coomassie Blue

Pengukuran Berat Molekul Protein Sampel

Elektroforesis dengan kondisi protein yang sudah terdisosiasi dapat dipakai untuk memperkirakan berat molekul suatu protein. Berat molekul tersebut dapat ditentukan dengan mengukur mobilitas molekul protein dalam gel poliakrilamid (yang mengandung SDS) berdasarkan kurva standar berat molekul dari protein standart. Protein standar yang diketahui berat molekulnya dapat dielektroforesis dan mobilitasnya pada gel poliakrilamid dapat diukur. Mobilitas rate (Mr atau Rf) diukur dengan memakai rumus berikut.

Gambar 7 Estimasi Berat Molekul menggunakan SDS-PAGE. (A) Separasi Berat Molekul Protein Standar dan Protein Sampel pada 7% SDS-PAGE. (B) Kurva Kalibrasi untuk Estimasi BeratMolekul.

            Protein dengan berat molekul tertentu mempunyai nilai Rf tertentu pula. Bila dipakai 5 jenis protein standar dengan berat molekul yang berbeda, maka akan didapatkan 5 nilai Rf yang berbeda pula. Untuk membuat kurva kalibrasi berat molekul, kelima nilai Rf ini ditempatkan sebagai sumbu X dan berat molekul (biasanya dinyatakan sebagai fungsi dari log berat molekul) ditempatkan sebagai sumbu Y. Grafik yang didapatkan berupa grafik linier dengan persamaan garis y = a + bx. Mobilitas dari suatu protein (yang belum diketahui berat molekulnya) dapat diukur dengan rumus di atas dan berat molekulnya dapat dicari dengan mengeplotkan langsung pada kurva standar berat molekul atau dapat dihitung dengan menggunakan persamaan garis dari kurva standar berat molekul.