High Performance Liquid Chromatography

ANALISIS ASAM AMINO DENGAN METODE High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

           

  Oleh :

Alim Sethiti                             (135080301111030)

         

TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

2015

I.     PENDAHULUAN

Latar  Belakang

Dalam protein terdapat 20 asam amino utama yang berperan sebagai pembangun. Masing - masing asam amino berbeda satu dengan yang lain pada rantai sampingnya atau gugus R. Asam amino yang dapat disintesis sendiri oleh makhluk hidup disebut asam amino non-esensial, sedangkan asam amino yang tidak dapat disintesis sendiri dan harus diperoleh dari makanan disebut asam amino esensial (Toha, 2001).

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO₄). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.

Analisis profil protein yang dilakukan meliputi penentuan kadar dan bobot molekul protein, sedangkan analisis asam amino dilakukan dengan menggunakan HPLC (Utami, 2012; Rutherfurd and Dunn, 2011). Asam Amino dianalisis menggunakan HPLC. Prinsip analisis asam amino ini adalah asam amino dari protein dibebaskan melalui hidrolisis dengan HCl 6 N. Hidrolisat dilarutkan dengan buffer sodium sitrat dan masing-masing asam amino tersebut akan dipisahkan dengan menggunakan HPLC. Sebelum dilakukan proses hidrolisis terlebih dahulu dilakukanekstraksi protein dengan menggunakan metode Kjeldahl. (AOAC, 2005).

Akhir-akhir ini analisis asam amino lebih sering menggunakan kromatografi cair dengan kinerja tinggi atau yang lebih dikenal dengan istilah High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Muchtadi 1989). Kromatografi cair merupakan teknik pemisahan yang cocok digunakan untuk memisahkan senyawa yang tidak tahan terhadap pemanasan, seperti asam amino, peptida dan proteinKromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya

II.  PEMBAHASAN

2.1     Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) / HPLC

Pengenalan teknik kromatografi cair kinerja tinggi, atau HPLC membuka dimensi baru dalam analisis protein, peptida dan asam amino, terutama dari segi efektivitas pemisahan, kecepatan analisis dan sensitivitas deteksi. Hal ini karena dengan HPLC campuran analit dapat dipisahkan secara langsung dalam kolom yang sesuai, seperti dalam metoda analisis asam amino. Dalam metoda ini digunakan kolom penukar ion (kation) resin polistiren tersulfonasi dalam bentuk Na(+). Asam amino yang dilarutkan dalam dapar pH 2.2, sehingga terdapat dalam bentuk kation dengan muatan positif . Asam amino ini akan mendesak dan menggantikan ion Na yang terikat pada resin. Kekuatan ikatan elektrostatik ini bervariasi sesuai dengan perbedaan derajat ionisasi masing-masing asam amino.

Apabila sebagai eluen digunakan larutan dapar dengan pH 3, asam amino yang bersifat basa, seperti lisin, arginin dan histidin, akan tetap terikat kuat pada resin karena ikatan elektrostatik yang kuat, sedangkan asam amino yang bersifat asam, seperti asam glutamat dan asam aspartat, karena ikatan elektrostatik dengan gugus sulfonat pada resin lemah, akan terlepas dan terelusi keluar dari kolom. Dengan menaikkan pH secara bertahap dan pengaturan konsentrasi NaCl dalam eluen, masing-masing asam amino akan terpisah dan terelusi dari kolom dengan waktu retensi yang berbeda-beda. Asam aspartat akan terelusi paling awal dan arginin akan terelusi paling akhir.

Identifikasi asam amino yang telah terelusi dari kolom dapat dilakukan terhadap gugus -NH2 (amin primer), dengan derivatisasi pasca kolom menggunakan pereaaksi ninhidrin dalam suasana alkalis pada temperatur 100.Hasil reaksi antara asam amino dan ninhidrin ini secara visual berwarna ungu, yang dapat digunakan sebagai dasar pengukuran spektofotometri pada panjang gelombang serapan maksimum di sekitar 570 nm. Pengukuran serupa harus dilakukan pula pada 440 nm, karena hasil reaksi antara asam amino (prolin hidroksi prolin) dengan ninhidrin merupakan senyawa berwarna kuning dengan panjang gelombang serapan maksimum disekitar 440 nm.

Derivatisasi dalam HPLC bertujuan untuk mengubah analit menjadi bentuk yang dapat terdeteksi oleh sistem detektor yang digunakan, sesuai dengan sensitivitas yang diperlukan. Untuk mendapatkan sensitivitas dan selektivitas yang tinggi digunakan detektor spektrofluorometer. Dalam hal ini derivatisasi dilakukan supaya didapat senyawa yang berfluoressensi kuat. Derivatisasi asam amino dengan o-ftalaldehid (OPA) atau dengan 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfonil klorida (dansil klorida) sering dilakukan secara pra- kolom maupun pasca-kolom.

2.2 Analisis asam amino dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Analisis asam amino dengan metode HPLC mempunyai 2 tahap prosedur yaitu : Pertama pembuatan pereaksi OPA (ortho-phtalaldehyde), OPA 50 mg, metanol 4 ml, mercaptoemetanol 0,025 ml, brij 30% 0,050 ml, buffer borak 0,5 M, pH 10,4. Kedua dengan dilakukan fase mobile A yang terdiri NA acetat hidrat 2 g, metanol 90 ml, NA EDTA 0,5 g, THF 10 ml. Dicampur dengan air HP menjadi 1 liter dengan labu ukur kemudian diatur pH menjadi 6,5 dengan NaOH. Selanjutnya fase mobile B yang terdiri Metanol 95%, Kedua fase mobile disaring dengan saringan membran 0,45μl (Anwar Nur et al, 1992).

Selanjutnya dilakukan preparasi sampel. Masukkan sampel yang mengandung 3 mg protein kedalam tabung ulir, lalu tambahkan 1 ml HCl 6 N. Hidrolisis dengan memanaskan tabung dalam oven dengan suhu 110⁰C selama 24 jam lalu dinginkan sampel, kemudian saring sampel dengan suntered glass, bilas beberapa kali dengan HCl 0,01 N. Keringkan dengan vacum evaporator. Larutkan kembali sampel yang dikeringkan dengan 5 ml HCl 0,01 N. setelah semuanya selesai maka sampel sudah siap disuntikkan kedalam HPLC.

Cara injeksi sampel kedalam HPLC yaitu : Sampel yang sudah siap ditambahkan kalium borak dengan perbandingan 1:1, kedalam vial kosong dimasukkan 5 μl sampel diatas kemudian ditambah 25 μl pereaksi OPA, biarkan selama 1 menit agar derivatisasi berlangsung sempurna. Injeksikan sampel kedalam HPLC sebanyak 5 μl kemudian tunggu sampai pemisahan asam amino selesai, waktu yang diperlukan sekitar 30 menit.

2.3    Komponen pada HPLC

Gambar 1. Komponen HPLC

Pompa (Pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

Injektor (injector)

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :

a. Stopped Flow

b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada     Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom.

Kolom (Column)

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 - 6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC).

  

Detektor (Detector) .

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:

Detektor Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa

Detektor lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks

Detektor Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia

Data Processor

Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak – puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.

2.4    Kelebihan dari Metode HPLC / KCKT

KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya Kelebihan itu antara lain: mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah melaksanakannya, kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis, Resolusi yang baik, dapat digunakan bermacam-macam detektor, Kolom dapat digunakan kembali dan mudah melakukan "sample recovery"

KESIMPULAN

Untuk menganalisis protein terutama uji analisa asam amino dapat dilakukan dengan berbagai metode namun metode yang lebih modern dan banyak digunakan adalah dengan metode HPLC, karena metode ini lebih banyak kelebihannya dari pada metode lain. Metode HPLC memiliki beberapa  komponen didalamnya seperti pompa, injektor, kolom, detektor dan data prossecor.

DAFTAR PUSTAKA

Anwar Nur. M. H. Adijuwana, Kosasih. 1992. Teknik Laboratorium. Dep. Pendidikan, dan Kebudayaan Ditjen DIKTI. Pusat antar Universitas Ilmu Hayat Institute Pertanian Bogor.

[AOAC] Association of Official Analitical Chemist. 2005. Official Methods of Analysis of The Association of Official Analytical Chemist18th Edition. Gaithersburg, USA: AOAC International.

Muchtadi, D. 1989. Petunjuk Laboratorium Evaluasi Nilai Gizi Pangan. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Rutherfurd, S.M., and Dunn, B.M., 2011, Quantitative Amino Acid Analysis. Curr Protoc Protein Sci. Chapter 3: unit 3:2. John Wiley & Sons., Inc. Doi:10.1002/0471140864.

Sumarno., dkk. 2002. ESTIMASI KADAR PROTEIN DALAM BAHAN PANGAN MELALUI  ANALISIS NITROGEN TOTAL DAN ANALISIS ASAM AMIN. Univeraitas Gajah Mada : Majalah Farmasi Indonesia 13(1), 34 –43, 2002

Toha, A. H. 2001. Biokimia: Metabolisme Biomolekul. Bandung: Alfabeta.